血管生成實驗步驟－實驗方法完善版
前言
無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實驗就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。本實驗以HUVEC細胞為例，介紹這一實驗的詳細過程。
圖一 血管生成鏡檢圖
一.實驗材料和實驗方法
1.實驗材料
2.實驗方法：
2.1實驗流程介紹
圖二 實驗流程圖
（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）
2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹
圖三 血管生成載玻片縱截面示意圖
（Matrigel鋪在下孔，細胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）
2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹
圖四 實驗結(jié)果收集和分析流程圖
（在特定的時間點采集圖片，并且進行圖像分析（Wimasis全自動分析）測量小管長度，成環(huán)數(shù)，細胞覆蓋面積和結(jié)點。之后在對測量結(jié)果進行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。）
一.實驗步驟
1、準備基質(zhì)膠
1.實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel）
2.開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
3.打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。
4.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。
由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結(jié)果。
如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：
我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。
如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
2、凝膠
1.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2.準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
3.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4.將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
5.等待同時準備細胞懸液。
3、鋪細胞
1.準備密度為2*105cells/ml的細胞懸液，充分混勻。
2.將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3.每孔加入50μl的細胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠。可以使用排槍。
4.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5.蓋上蓋，靜置，一段時間后，所有細胞都會沉下去落在Matrigel的表面。
加入細胞的量直接影響實驗結(jié)果，所以在正式實驗開始之前，要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預實驗。獲得理想比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個細胞即可。
可以按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點數(shù)進行測量和記錄，并且對其進行統(tǒng)計分析。
5、免疫熒光染色
根據(jù)需要，可以對成管結(jié)果進行免疫熒光染色。
小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細胞網(wǎng)絡。
加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
在室溫下避光孵育30分鐘。
使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細胞。
使用 485 nm/ 529 nm進行免疫熒光成像。
實驗優(yōu)勢
1.這個實驗方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠，降低實驗成本；
2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好。
圖五 成像對比
（左側(cè)ibidi血管生成載玻片無凹液面，整個視野成像清晰；右側(cè)96孔板有凹液面，中間清晰周圍模糊。）
滬公網(wǎng)安備31011202005471 
